ヒト免疫細胞のシングルセル 完全長 cDNA シークエンス

免疫細胞のcDNAを完全長で、シングルセルで読んだ、と言う論文。
この話題は前にも触れましたがBioRxvに出ていましたので紹介します。

Highly Multiplexed Single-Cell Full-Length cDNA Sequencing of human immune cells with 10X Genomics and R2C2

リンクはこちら
このタイトルにあるR2D2、じゃなかった、R2C2とはなんのこっちゃ？　最初私もハテ？と思っていたのですがこれはThe Rolling Circle Amplification to Concatemeric Consensus
とのことだそうです。同じ著者のこちらの文献に詳しく書いています。
ONTのデータです。PacBioのCCS、HiFiとはちょっと違いますが目的は同じ。同じ場所を何回か読んで精度を高めるというものです。

この論文、目的は

1. 免疫細胞の遺伝子発現をシングルセルレベルで検出し、
2. その遺伝子（mRNA)を完全長で捉え、
3. それによりアイソフォーム配列も区別し、
4. T細胞レセプター・B細胞レセプターのもっとも変異の多い部位の配列をペアで決定する（免疫レパトア解析）

というもの。

完全長で捉えるというところがキーです。ショートリードで行うと１と４はできる。でも２と３は難しい。

彼らはPBMCを使っていて、およそ3000細胞からデータを得ています。

３’発現キットを使ってメッセンジャーをキャプチャーしています。＜ー個人的にはここがちょっとびっくりした。10xのノーマルのプロトコルだと、免疫細胞のTCR・BCRレパトア解析をする場合、５’発現キットを使います。というのもTCR・BCRの変異領域は遺伝子の５’側に寄っているので、５’側を読まないといけないから。

とはいえ、良く考えたら、ショートリードで読むことを想定しているから３’側と５’側のライブラリ作製キットを使い分けているのですよ。

どちらも一度は完全長のcDNAを作り、その後ショートリード用にライブラリをカットしているので、もし完全長cDNAを全部読めるのであれば３’のキットでメッセンジャーをキャプチャーしても問題無い。

（この辺、解りづらかったらお知らせください）

シングルセル３’キットでメッセンジャーをキャプチャーして、一旦cDNAを作り（この辺のPCR伸長時間に工夫があるみたいです）一方はショートリード用、もう一方はR2C2用にしてライブラリを作製、シークエンスしています。

PBMCなのでT細胞、B細胞、単球が綺麗にクラスターに分かれています。

Volden et al., DOI 10.1101/2020.01.10.902361v1 より

この後のアイソフォーム解析は、ロングリードならでは。

B細胞、T細胞、単球に発現している遺伝子が、それぞれ異なるアイソフォームを持っていたことを彼らは論文中で示しています。

さらにレパトア解析、TCR・BCRの遺伝子のペア解析もロングリードで行なっています。

（これは正直、ショートリードでやってもできるよ、と言いたいけれど言いません）

こういう論文を読んでいると、PacBioのIso-Seqを思い出します。完全長cDNAのアイソフォーム解析です。これがシングルセルのレベルでできるようになったのか〜。感慨深い