Visium空間解析始めませんか？（パート２）

 ここではもう一度、Visium空間解析のおさらいをしましょう！

Visiumスライドの説明「Visium空間的遺伝子 発現テクノロジー」カタログより

Visiumの遺伝子発現スライドにはキャプチャーエリアという、一辺は６.５mmからなる正方形のエリアが4つある。この中には5000個のスポットがあり、各スポットは直径55μmで、隣り合うスポットの中心間の距離は100μmである。

さて、この直径55μm（子供の髪の毛の太さがこのくらいらしい）のスポットに、数百万本のDNAオリゴが並んでいる。このオリゴはガラススライド側からリード１（後のシーケンスに使う）、空間バーコード、UMI、一番外側がPoly (dT）からなる。Poly (dT）オリゴがメッセンジャーRNAのPolyAを捉えることになるのだ。

正方形のキャプチャーエリアの上に、組織切片を載せて、酵素処理を行い、細胞に穴を開ける。すると、細胞内に含まれていたメッセンジャーRNAがスライドの上に落ちてくる。

落ちてきたmRNAは、先ほどのオリゴの先端のPoly (dT)によって捉えられ、その後逆転写によって cDNAが作られる。逆転写がmRNAの5’側に達したら追加でCCCオリゴを追加する、特別な酵素を用いていて、次に作られる２ndストランドの鎖はGGGがついたプライマーによって行われる。そうすると２ndストランドの鎖はUMI、空間バーコード、リード１の部分まで作られる。

ここでできるcDNAは、cDNAの全長＋UMI＋空間バーコード＋リード１である。←ここ重要！

その後cDNAプラスアルファの配列は酵素処理されて断片化されて、NGSライブラリーが作られる。転写物の方はポリAに近い方がショートリードで読まれる。なのでこれは３’発現解析とも言える。バーコードの方はUMI＋空間バーコード＋リード１が読まれる。ここでバーコードとは何か？

UMI：スポット内のオリゴには異なる配列が設計されている。同じスポットには同じUMI配列は、無い。なので 、同じスポット内に限れば、発現遺伝子の転写産物には一種類のUMI配列がついていることになる。例えば後にPCRで増やす時、配列が増えやすい増えにくいに限らず、同じUMIを持っていれば元は同じ転写産物クローンだったということになる。発現値を測るのに適切な方法はUMIを数えれば良い。RPKMとかのノーマライズは必要ない。と言える。

空間バーコード：これはスポット内のオリゴには同じ配列が設計されている。しかし、異なるスポットには異なるユニークなオリゴが設計されている。つまり、空間バーコードを読むことによって、どのスポット由来の転写産物だったのかがわかる。キャプチャーエリアの正方形には5000のスポットがあるので、5000個の住所がある。この住所が書かれたのが空間バーコードだと思って良い。

UMIと空間バーコード：さて、スライドに落ちてきたmRNAは、 cDNAにされるときにこのUMIと空間バーコードが付けられる。この組み合わせを読むことで、どの遺伝子が（cDNA）、どれくらい（発現量・UMI）どこで（アドレス・空間バーコード）発現していたのか、がわかるようになるのだ！　すごい！

とまあ、文章にすると結構わかりにくいかもしれない。実際言葉で言っても伝わらないこともある。図にしてプレゼンするのが一番なのかなー

さてさて、現在（2021年2月）は、新鮮組織切片からスタートする方法である。しかしこれもFFPEからスタートできるキットが今年出れば、実験の可能性も大きく広がると思う。

現在でも、メインはHE染色だが免疫蛍光染色にも対応しているので、遺伝子発現と同時にタンパク質発現の局在を捉えることができる。

ところで、「cDNAの全長＋UMI＋空間バーコード＋リード１」ができると途中で書いたけど、これはつまり、読もうと思えばショートリードではなく、ロングリードで読めば、全長 cDNAも読めてしまうということ！　私が3年前まで全力で応援していたあのロングリードですよ。と言ってもまだショートリードがメインです。論文でもショートリードが圧倒的に多いです。

はい、今日も最後はウェビナーのお知らせ。

Visiumを使った研究者の生の発表です！　2月25日（木）午後2時からです。
国立がん研究センター研究所の森裕太郎先生を演者に迎えて、がんサンプルを用いたVisium空間解析の実例紹介

今年、間違いなく、Visium空間解析は熱いです！

あ、もちろんシングルセルもね。😆