「Visium Spatial : 空間的遺伝子発現の疑問にお答えします」のブログの紹介

今年は暖冬で雪が少ないそうですね。暖冬の年は花粉が飛ぶ時期も早まるらしく、そうなると夏はどうなるんだろう？猛暑？水不足？

さて、前もここに書いたSpatialです。製品名はVisium Spatial（ビジィウム・スペーシャルと発音します）Gene Expressionです。マーケティング的にはVisium 空間的遺伝子発現と訳しています。

その新しい製品ですが今年、あちこちで話題になることは間違いない！と思っています。2020年の流行語大賞バイオ編というのがあればVisiumがノミネートされるかな。

10xのブログにて、そのVisiumのFAQが出ています。ブログはこちら

せっかくなので一部日本語に訳してみました。

イントロダクション

10x Genomicsでは、複雑な組織生物学に潜む空間的なダイナミクス、正常組織の発生や疾患病理学に影響する微小環境の細胞の働きを捉えることを可能にしています。10x GenomicsのVisium空間的遺伝子発現ソリューションを使用すれば、ターゲット遺伝子だけでなく全体のmRNAをインタクトな組織切片から得て、遺伝子発現情報を高解像度なH＆E染色画像上に重ね合わせることができます。

このソリューションは組織切片作成、H＆E染色、顕微鏡画像検出といったこれまでの病理学的な方法に、次世代シーケンス技術を統合して行います。そのため、10x Genomicsでは、scRNA-seqまたは組織解析の専門家のどちらにも有用な、トレーニングウェビナーを準備していますました。

Getting Started with the Visium Spatial Gene Expression Solution. Watch on-demand →


Exploring New Frontiers - Analyzing and Visualizing Visium Gene Expression Data. Watch on-demand →

ちなみに製品に関するウェブサイトは日本語でも用意しているので、こちらのほうが初心者はわかりやすいかもしれません。

組織準備に関するよくある質問

Visium Spatial Gene Expressionスライドに、異なる組織サンプルを同時にのせることはできますか？
はい、１つのスライドには４つのキャプチャーエリアがあり、４種類の異なるサンプルはそれぞれのエリアに乗せて測定することができます。但し、最適な透過処理時間をTissue Optimization（TO）スライドを使い、組織ごとにあらかじめ測っておく必要があります。


フォルマリン固定（FFPE）の組織は使用できますか？
OCTの新鮮な冷凍組織のみ確実にテストされています。10x GenomicsのR＆DではFFPEでの方法を積極的に研究しています。


IHC染色した組織は使えますか？
現在、Visium空間的遺伝子発現のワークフローはH＆E染色に最適化されています。　IHC染色からの方法も10xでは研究中です。


組織切片の厚さの最大値はありますか？
最適な切片の厚さは組織に依存します。例えば脂肪が多い組織の場合はより厚い切片が必要です。クオリティを保ちつつ組織に合った最小の厚さで切ることが大切です。　社内では５〜３５μmでテストしたことがありますが、ほとんどの場合10 µmで切ります。

組織ごとの推奨する切片の厚さについてはこちら
凍結切片の詳細はこちら

Visium Spatial Gene Expressionスライド

４つのキャプチャーエリアには、約5000個のバーコードスポットがあり、各スポットには数百万本ものバーコード付きオリゴ配列が並んでいます。組織内のmRNAは、酵素による透過処理行なった後に放出され、バーコードオリゴに結合し、遺伝子発現情報として測定できるようになります。

１つのスポットが複数の細胞タイプをキャプチャーすることはありますか？
はい。組織の種類や組織内の細胞の大小密度によります。スポットの直径は50μm、隣り合うスポットの中心間の距離は１００μmです。スポットあたり平均して1〜10個の細胞が捉えられると想定してください。ですからこれらの細胞は同じ細胞タイプで無い可能性もあります。私たちは、数個の「ミニバルク」細胞の平均遺伝子発現値を見ることになります。10xではこのスポットサイズをより小さくできないか研究を続けています。


同じスライドまたは異なるスライドの切片測定値に差はありますか？
難しい質問です。各組織は独特で元々差があるからです。同じスライド内または異なるスライド間で遺伝子発現データを一定に保つ最も有用なポイントは、組織のクオリティコントロールです。これは熟練した組織と切片準備の技術を伴います。

テクニカルリプリケートを作るのも良いでしょう。R＆Dではマウス脳の４つの連続する切片を同じスライドにのせた実験を、違うスライドを使って6週間続けました。遺伝子発現のテクニカルリプリケート間でのR相関係数は0.99で、これは相関が高いことを示します。一般的にテクニカルリプリケートは実験結果の信頼性を高めます。


使わない箇所がある場合スライドは再利用できますか？

いいえ。使わないキャプチャーエリアがあったとしても、スライド使用は一度限りです。これはワークフローの中に、染色、リンス、乾燥のステップが他の使わないエリアのオリゴ配列にも影響し結果として全体的な感度を落としてしまうからです。


イメージングテストスライドの目的は何ですか？
Visiumアクセサリーキットに含まれるイメージングテストスライドには、２つの目的があります。ひとつはユーザーのイメージングシステムがVisiumに適合しているかを調べる目的、もうひとつは後の実験のためにイメージングプログラムをセットアップすることです。　詳細はこちら《 Imaging Guidelines Technical Note》

データ解析について

データ解析のためにプログラミングやバイオインフォマティクスの経験は必要ですか？
最低限のバイオインフォマティクススキルがあればSpace Rangerを動かすことができます。Space RangerはLinuxマシンの上で動くので、Linuxの基本操作コマンドを知っておくことは必要です。しかしSpace Rangerのほとんどのコマンドは自動で動きます。Space Rangerで必要な設定ファイルやアルゴリズムはソフトウェア内に同梱されているので、２つのインプットファイルさえ指定すれば解析は実行できます。

Loupe BrowserはGUIで動くためプログラミングのスキルは必要ありません。しかし解析を進めるうちにある箇所の遺伝子発現データを選択して再解析したい場合もあるでしょう。そういった場合はRや他のスクリプトを覚えて実行することが必要かもしれません。


SeuratのようなRで動く他の解析ツールはありますか？
はい、あります。SeuratのほかにはSpanielやGiottoというツールがあります。Space Rangerから出力されるマトリクスファイルは、Cell Ranger のFeature Barcodeマトリクスと同じフォーマットです。これはそのままSeuratに読みこませることが可能です。

これ以外にも10x Genomicsでは複数遺伝子やUMI、サンプル、クラスター等を同時に可視化するためのR resourcesも作っています。興味のある方はぜひお試しください。

こちらのブログもVisiumの空間的遺伝子発現解析について紹介しています。ご参照ください。



最後になりましたが、今年の3月5日木曜日、Visiumセミナーを東京で行います！　ユーザーの先生のご発表と10xの製品担当、AGBTでの最新情報などなど、この技術の最新に触れたい人には見逃せないイベント。場所等正式に決まりましたらまたいろんなチャンネルでお知らせ致しますのでお楽しみに！
 

ヒト免疫細胞のシングルセル 完全長 cDNA シークエンス

免疫細胞のcDNAを完全長で、シングルセルで読んだ、と言う論文。
この話題は前にも触れましたがBioRxvに出ていましたので紹介します。

Highly Multiplexed Single-Cell Full-Length cDNA Sequencing of human immune cells with 10X Genomics and R2C2

リンクはこちら
このタイトルにあるR2D2、じゃなかった、R2C2とはなんのこっちゃ？　最初私もハテ？と思っていたのですがこれはThe Rolling Circle Amplification to Concatemeric Consensus
とのことだそうです。同じ著者のこちらの文献に詳しく書いています。
ONTのデータです。PacBioのCCS、HiFiとはちょっと違いますが目的は同じ。同じ場所を何回か読んで精度を高めるというものです。

この論文、目的は

1. 免疫細胞の遺伝子発現をシングルセルレベルで検出し、
2. その遺伝子（mRNA)を完全長で捉え、
3. それによりアイソフォーム配列も区別し、
4. T細胞レセプター・B細胞レセプターのもっとも変異の多い部位の配列をペアで決定する（免疫レパトア解析）

というもの。

完全長で捉えるというところがキーです。ショートリードで行うと１と４はできる。でも２と３は難しい。

彼らはPBMCを使っていて、およそ3000細胞からデータを得ています。

３’発現キットを使ってメッセンジャーをキャプチャーしています。＜ー個人的にはここがちょっとびっくりした。10xのノーマルのプロトコルだと、免疫細胞のTCR・BCRレパトア解析をする場合、５’発現キットを使います。というのもTCR・BCRの変異領域は遺伝子の５’側に寄っているので、５’側を読まないといけないから。

とはいえ、良く考えたら、ショートリードで読むことを想定しているから３’側と５’側のライブラリ作製キットを使い分けているのですよ。

どちらも一度は完全長のcDNAを作り、その後ショートリード用にライブラリをカットしているので、もし完全長cDNAを全部読めるのであれば３’のキットでメッセンジャーをキャプチャーしても問題無い。

（この辺、解りづらかったらお知らせください）

シングルセル３’キットでメッセンジャーをキャプチャーして、一旦cDNAを作り（この辺のPCR伸長時間に工夫があるみたいです）一方はショートリード用、もう一方はR2C2用にしてライブラリを作製、シークエンスしています。

PBMCなのでT細胞、B細胞、単球が綺麗にクラスターに分かれています。

Volden et al., DOI 10.1101/2020.01.10.902361v1 より

この後のアイソフォーム解析は、ロングリードならでは。

B細胞、T細胞、単球に発現している遺伝子が、それぞれ異なるアイソフォームを持っていたことを彼らは論文中で示しています。

さらにレパトア解析、TCR・BCRの遺伝子のペア解析もロングリードで行なっています。

（これは正直、ショートリードでやってもできるよ、と言いたいけれど言いません）

こういう論文を読んでいると、PacBioのIso-Seqを思い出します。完全長cDNAのアイソフォーム解析です。これがシングルセルのレベルでできるようになったのか〜。感慨深い

Visium Spatial Transcriptomicsのウェビナー 日本語

なんか前の投稿を見たらこれもウェビナーの告知だったなー。同じネタですみません。NGS現場の会、シングルセルゲノミクス研究会、のメーリスでも流れましたが、11月19日（火）の午後2時からVisium Spatial Transcriptomicsの日本語ウェビナーを行います。登録サイトはこちらから

登録サイトはこちらから

で、そもそもVisium って何？　ってかたがいると思いますが、これは in situ hybridization とRNA-Seqの両方を合体させたようなイメージです。

1. 組織の凍結切片を用意する（組織により異なるがおよそ10μmの厚さ）
2. 切片を特殊なスライドガラスの上に載せる
3. H&E染色する
4. Permebilization処理をして組織に穴を空け、mRNAをガラスの上に落とす
5. ガラス上に敷き詰められているオリゴのポリdT配列でmRNAを捉える
6. ガラス上でmRNAを逆転写し、cDNAを作る
7. cDNAを回収、増幅し、NGSライブラリを作る
8. NGSシーケンスをする
9. データ解析

ここで肝となるのはガラス上のキャプチャーオリゴ。これにはガラス上に（キャプチャーエリアという１辺６.５mmの正方形の中に）敷き詰められている約５０００のスポットには、それぞれ住所IDが付いていて、そのIDごとに異なるバーコード配列がオリゴに含まれている。

cDNAを作る時に同時にそのバーコード配列も取り込まれ、NGSで読まれます。

1. 遺伝子（mRNA、cDNA）の部分的な配列（３’側）、と
2. スポットごとに異なるIDのバーコード配列

の両方を同時に取得します。（ペアエンドで読むので）

１で遺伝子の発現がわかり、２でその遺伝子がどのスポットから得られたのか、がわかる

つまり、どの遺伝子がどのくらい、組織のどこで発現していたのか、が同時にわかる。

カタログはこちらから落とせます

で、そのウェビナーが火曜にあるんですね。

日本語でやるので多くの人に聞いてもらいたい。時間の都合がつかない方はレジストだけでもしてもらえれば後でビデオなり資料なりのお知らせが行くと思います。

まさに、次世代の発現解析、ですよ。そしてこれは来年、もっともっとメジャーになることは間違いありません。

ちなみに、これのソフトウェアについてのウェビナーも21日の12時から（これは英語ですが）行われます。こっちはまず19日のウェビナーの内容を知っているのが前提で進められますので、両方の参加をオススメします。

Visiumのウェビナー：技術紹介とデータ解析について（英語）

ご無沙汰しました。本当にご無沙汰です。本業が忙しくてこちらの方はおろそかになっていたことをお詫びします。
前回の投稿から早２ヶ月、その間国内のイベントでは

• シングルセルゲノミクス研究会
• がん学会
• 大阪ユーザーグループミーティング

あとVisium Spatial Gene Expression のセミナーやウェビナー、などを主に行っていました。その間、日本語のウェブサイトも完成し、資料なども少しずつ日本語化を実現。もちろんこういうことはチームワークが大事です。10xの社風、というか良いところは、チームワークがバランス良く取れているということでしょうか。みんながみんな、持てる力をフルに生かせる職場って、理想ですよね（バーチャルオフィスですが）。

ついでに言うと、その間台湾と韓国でもいくつか大きな学会があり、ソウルでも先週ユーザーミーティングをやっていました。

Visiumは間違いなく、今年下半期（つまり今）から来年いっぱいにかけて、注目されると思います。あちこちでセミナーしてもみんな興味を示してくれる。

そこで、今月から来月にかけて、日本時間の正午からウェビナーを２つ行います。

ちなみにこのウェビナーはどちらも英語です。でももし日本語でやって欲しいという要望が多ければ、日本語でも予定しますので視聴後に表示されるアンケートのところにそう書いてください。

まず最初は、10月29日のお昼から行われる、Visiumの製品紹介と技術、プロトコルについてのウェビナー　Getting Started with the Visium Spatial Gene Expression Solution
登録はこちらから

2回目は、11月21日に行われる、Visiumのデータ解析、ソフトウェアについてのウェビナー　Exploring New Frontiers - Analyzing and Visualizing Visium Gene Expression Data
登録はこちらから

どちらも時間は12時からです。お昼休みに英語のウェビナーをぜひどうぞ。
あとで録画も見れますので登録だけでも忘れないうちにしてみてください。

では

シングルセルATAC-Seqの論文

毎日暑い日が続いていますね。冷房無しでは生きていけない、暑さに弱い私です。
先日、近所で花火大会があったので見に行きました。打ち上げ花火の開いた形って、なんと無く、細胞に似てません？　核と細胞質、ほら

さてさて、シングルセルのATAC-Seqといえば、ゲノムのオープンクロマチン領域を狙ってライブラリを作りシークエンスして、遺伝子の制御領域をシングルセル単位で明らかにするという技術ですよね。

そのATAC-Seqを使ったユーザーからの論文がNatureにPublishされました！

Howard et al.のシングルセルATAC論文

この論文は、シングルセルATACのランドマーク的なものかもしれません。
シングルセルATACを10xのシステムで解析する方法とアドバンテージが、これを読めばだいたいわかる。私たちのプレゼンよりも、実際のユーザーのレポートの方が説得力ありますよね。
ひとつ、すごいな、というか私が気付いていなかっただけかもしれませんが、ATACのデータからCNV（コピー数変異）を推定することも可能かもしれないですね。
確かに、ATACはゲノムを見ているわけだし、遺伝子のコピー数はオープン領域のコピー数と関係ありますよね。

Howard et al., (2019) Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion. Nat. Biotech. 37, 925.

リンクはこちら

あともうひとつ、まだBioRxvですが、
こちらの論文も注目しています。ATACとCITE-Seqを組み合わせています。

シングルセルATACはまだ、発現に比べるとメジャーではありませんがそのぶん論文になりやすい！ということもあると思うので、ぜひATACってみませんか？

上級者向けシングルセルデータ解析ウェビナー2つ SeuratとATAC

シングルセルのデータ解析をやっている方へ、オススメのウェビナー（録画）があります！　ちょっと前にアメリカ時間で行われたのですが、録画がオープンになりました。

ひとつめはこれ

ATAC-Seqのデータ解析とビジュアライゼーションの話です。

ここから視聴できます。

写真の左上のMikeは先月の東京ユーザーミーティングにも来ましたね。右下のHankはアルゴリズム開発のエキスパートです。

もうひとつは、これ

こちらから視聴できます。
Seuratを開発しているNYU Center for Genomics and Systems BiologyのDr. Rahul Satija が、Seurat v3を使って様々なタイプのシングルセルデータを解析する方法を説明したウェビナーです。最初ちょっと早口かもしれません。ですがSeuratを少し使っている・これからやろうと思っている研究者にはオススメです。

ぜひどうぞ。

シングルセルDNAのウェビナー

4月から毎月ウェビナーをしています。英語、日本語、中国語、と３パターンあって私は日本語担当なんですね、もちろん。

さて、次の日本語のウェビナーは8月1日(木)の午後2時から。テーマはシングルセルDNAです。

コピー数変異をシングルセルで読む技術をご紹介します。
ぜひ登録の上、ご参加ください。録画するので当日参加できないひとも登録だけどうぞ。


因みに英語は7月30日、こちらから

ウェビナーって思った以上に結構大変なんです。
まず英語で作られたプレゼンを日本語にしないといけない。その時、英語の方がしっくり来る単語はそのまま英語で行こうかどうか悩みます。

そして日本語にしたとしても、それが聞き言葉として正確に伝わるかどうか、が問題。漢字を見れば明らかだけど聞いただけでは意味を間違えてしまう日本語って、結構あると思います。
例えば「陽性」と言うのを聞くと、私は「妖精」と間違えてしまうんです。（なんてロマンチックな！）これは冗談ですが、プレゼンは英語で書かれているのでそのまま「ポジティブ」と言った方が伝わりやすいかも、とか考えてしまいます。

次に読み方とパワポのスピード。自分で作った原稿を読むわけですが、読んでいないように見せかけないとダメで、しかもパソコンに向かっているわけです。　相手の顔が見えないからどうしても事務的になってしまったり、つまずいてしまったり。前回の免疫プロファイリングは途中噛んでしまい、緊張してしまいました。もっと練習しろ！ということですが。
録画バージョンはちゃんとリラックスした状態で撮り直していますので、聞きやすいと思います。

今度のDNAウェビナーは、前よりもリラックスして行いたい