私がバイオ業界に入るきっかけとなった最初の仕事は、ラボテクニシャンでした。そのラボは東京大学大学院医学系研究科 分子神経生物学講座。脳神経の研究をしているラボです。
当時私はグルタミン酸受容体の遺伝子のある場所をノックアウトしたマウスを作るため、ターゲッティングベクターを作ったり、細胞培養したり、シーケンス（キャピラリー）したり、分子生物学のいろいろな実験手法を使っていたわけです。その時の直属のボスとは今でも交流があります。
さて、そんな私ですが脳の研究者ではないので詳しいことはわからないですが、なんだかすごい論文を目にしました。
Volume 598 Issue 7879, 7 October 2021
Brain census
10月になり、朝晩は涼しくなってきましたね（東京）。今日は三日月
今年の癌学会は初日の9月30日が緊急事態宣言最終日、2日目の10月1日が台風で暴風雨、3日目になってようやく晴れるという、現地参加者にとってはなかなか厳しい日程でした。
私たちはブースも出して3日目にランチョンも行ったので通しで現地にいました。皆さんも知っているかもしれませんがパシフィコ横浜は、会議場と展示会場が少し離れています。移動するには一旦外に出ないといけないので（裏技はあるんだけど）、2日目は暴風雨のせいでほとんど展示会場に人は来ませんでした。
コロナ下での学会はほとんどがハイブリッド。その中で現地に来る研究者はどれくらいいるんだろう？って、始まるまでずーっと心配でしたが、会議場の方は意外とたくさんの人が現地参加していました。事務局発表では1,500名が現地参加、リモート参加が1,700名だったらしいです。
ほとんどの大きなセッションはオンデマンドもあるのでこれから参加する人も結構いるんでしょうかね。
今回は展示会場もかなりソーシャルディスタンス。ブースとブースの間が広々していましたが展示企業の数は少なかったですね。
そうです、今回Chromium X の実機を初めて公開しました！
向かって左側がX 右側が今までのController
今回の癌学会で特に思ったのは、シングルセルの発表が多かったこと。
私もツイッターで呟いていましたけれど、明らかにRNAシーケンスはバルクからシングルセルに移っているように感じました（もちろんバルクで十分な実験もあるけど）。今回Single Cellでタイトルを検索すると38の発表があったことがわかりました。実際はタイトルにはSingle Cellと書いていなくても手法としてシングルセルを使っていた発表もあったと思うから実数はそれよりはるかに多いと思います。（その38の発表はこちらにリストでまとめました）
特に以下の3つのセッションはシングルセルとマルチオミックス がメインテーマでした。おすすめです（全てオンデマンドあり）
鈴木先生には 20年3月のVisium Dayでもデータを少しお話し頂き、参加者の皆さんから多くの質問を頂いたことを覚えています。
続いてはこちら
Visiumといえばここで何回も紹介していますが、スポットサイズの直径が５５umの円が、約５,０００個、一辺６.５mmの正方形に並んでいます。
隣り合うスポットの中心間の距離は１００umなので、イメージとしてはこんな感じかな
前回から少し時間が経ってしまいましたね。まだまだ、東京は緊急事態宣言下で居酒屋は閉まったまま。すっかり健康的になってしまいました（これはいいことだけど）。これが6月20日まで続き、その後はワクチン接種、そしてオリンピックかあ。本当にやるのかなあ。
世の中不安なことが多い今日この頃ですが、さーて気持ちを切り替えて。
Visiumの空間解析にFFPE版が登場しました。FFPE−ホルマリン固定パラフィン包埋（さて、「包埋」とは何と読むでしょう？ 答え：「ほうまい」僕は最初読めませんでした、、、）。これは生体組織の保存に良く使われている手法です。
ホルマリンの濃度（中性か酸性か）、作成にかける時間などの条件によってサンプルのクオリティは変わってくるそうです。サンプルに含まれるDNA・RNAの分子の分解も進んでしまうことがあります。また組織の構造がきちんと保存されるかどうか、これもFFPE作成条件によって大きく変わってくるそうです。
ゲノム診断に使う病理組織は手術検体から得るわけですが、こちらは日本病理学会が定めた「ゲノム診療用病理組織検体取扱い規程」によってFFPEの作製方法などが定められています。
FFPEサンプルからRNA分子を測定して遺伝子発現量を測るには注意が必要です。そのままではRNAが分解されているからです。今までのVisium（新鮮凍結組織用）では、組織を透過処理し、mRNAのポリAをVisiumスライドガラス上のポリdT付きのキャプチャーオリゴで捉えていました。
ところがこの方法だと、分解されているmRNA はキャプチャーされない可能性がある。そしてNGSで読んでもマッピングされない可能性がある。
そこで、FFPE用のVisiumではポリAを捉えるのではなく、プローブキャプチャー法を用いました。具体的には、遺伝子の保存領域にプローブを2つ設計し、片方のプローブにはポリA配列がついている。この2つのプローブは隣り合うように設計されていて、ハイブリした後に2つは結合してひとつの長いプローブ配列になる。
その後Denatureして、透過処理をしてプローブ配列だけを組織からスライド上に落としてくる。プローブ配列についているポリA配列をスライド上のキャプチャーオリゴで捕捉する。という流れだけど文章で書いても伝わらないのはわかります。
そこで先月ウェビナーを行ったのでそのビデオをご覧ください。
これは5月19日に行ったウェビナーの録画なのですが、最初の方はVisium一般の復習なので知っている人はスキップできるかな。プローブでのキャプチャー方法についてはウェビナービデオの１８分後くらいから説明しています。
このウェビナーでは実験ワークフローの部分はさらっとしか話せませんでしたので、次はもっと詳しい話をします。次回のウェビナー、Visium空間的遺伝子発現 FFPEキットを始めよう！は6月23日（水）午後12時から。抽選で5名のかたにVisium特製Tシャツをプレゼントします！
製品シートはまだ英語版しかないですがここにあります（鋭意翻訳中！）
ここではもう一度、Visium空間解析のおさらいをしましょう！
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| Visiumスライドの説明「Visium空間的遺伝子 発現テクノロジー」カタログより |
Visiumの遺伝子発現スライドにはキャプチャーエリアという、一辺は６.５mmからなる正方形のエリアが4つある。この中には5000個のスポットがあり、各スポットは直径55μmで、隣り合うスポットの中心間の距離は100μmである。
さて、この直径55μm（子供の髪の毛の太さがこのくらいらしい）のスポットに、数百万本のDNAオリゴが並んでいる。このオリゴはガラススライド側からリード１（後のシーケンスに使う）、空間バーコード、UMI、一番外側がPoly (dT）からなる。Poly (dT）オリゴがメッセンジャーRNAのPolyAを捉えることになるのだ。
正方形のキャプチャーエリアの上に、組織切片を載せて、酵素処理を行い、細胞に穴を開ける。すると、細胞内に含まれていたメッセンジャーRNAがスライドの上に落ちてくる。
落ちてきたmRNAは、先ほどのオリゴの先端のPoly (dT)によって捉えられ、その後逆転写によって cDNAが作られる。逆転写がmRNAの5’側に達したら追加でCCCオリゴを追加する、特別な酵素を用いていて、次に作られる２ndストランドの鎖はGGGがついたプライマーによって行われる。そうすると２ndストランドの鎖はUMI、空間バーコード、リード１の部分まで作られる。
ここでできるcDNAは、cDNAの全長＋UMI＋空間バーコード＋リード１である。←ここ重要！
その後cDNAプラスアルファの配列は酵素処理されて断片化されて、NGSライブラリーが作られる。転写物の方はポリAに近い方がショートリードで読まれる。なのでこれは３’発現解析とも言える。バーコードの方はUMI＋空間バーコード＋リード１が読まれる。ここでバーコードとは何か？
UMI：スポット内のオリゴには異なる配列が設計されている。同じスポットには同じUMI配列は、無い。なので 、同じスポット内に限れば、発現遺伝子の転写産物には一種類のUMI配列がついていることになる。例えば後にPCRで増やす時、配列が増えやすい増えにくいに限らず、同じUMIを持っていれば元は同じ転写産物クローンだったということになる。発現値を測るのに適切な方法はUMIを数えれば良い。RPKMとかのノーマライズは必要ない。と言える。
空間バーコード：これはスポット内のオリゴには同じ配列が設計されている。しかし、異なるスポットには異なるユニークなオリゴが設計されている。つまり、空間バーコードを読むことによって、どのスポット由来の転写産物だったのかがわかる。キャプチャーエリアの正方形には5000のスポットがあるので、5000個の住所がある。この住所が書かれたのが空間バーコードだと思って良い。
UMIと空間バーコード：さて、スライドに落ちてきたmRNAは、 cDNAにされるときにこのUMIと空間バーコードが付けられる。この組み合わせを読むことで、どの遺伝子が（cDNA）、どれくらい（発現量・UMI）どこで（アドレス・空間バーコード）発現していたのか、がわかるようになるのだ！ すごい！
とまあ、文章にすると結構わかりにくいかもしれない。実際言葉で言っても伝わらないこともある。図にしてプレゼンするのが一番なのかなー
さてさて、現在（2021年2月）は、新鮮組織切片からスタートする方法である。しかしこれもFFPEからスタートできるキットが今年出れば、実験の可能性も大きく広がると思う。
現在でも、メインはHE染色だが免疫蛍光染色にも対応しているので、遺伝子発現と同時にタンパク質発現の局在を捉えることができる。
ところで、「cDNAの全長＋UMI＋空間バーコード＋リード１」ができると途中で書いたけど、これはつまり、読もうと思えばショートリードではなく、ロングリードで読めば、全長 cDNAも読めてしまうということ！ 私が3年前まで全力で応援していたあのロングリードですよ。と言ってもまだショートリードがメインです。論文でもショートリードが圧倒的に多いです。
はい、今日も最後はウェビナーのお知らせ。
Visiumを使った研究者の生の発表です！ 2月25日（木）午後2時からです。
国立がん研究センター研究所の森裕太郎先生を演者に迎えて、がんサンプルを用いたVisium空間解析の実例紹介
今年、間違いなく、Visium空間解析は熱いです！
あ、もちろんシングルセルもね。😆
Nature Method誌によって2020年のMethod of the Yearに選ばれた、Spatially Resolved Transcriptomics ＝ 空間的に解析するトランスクリプトミクス
これを商品化したのが、10xのVisium 空間解析。ちょうど1年前にこのブログでも紹介していました。ここ
これは専用のスライドガラス上に組織切片を載せて、発現遺伝子（m RNA）を直接補足、どんな遺伝子が組織のどこで発現していたのかがわかる技術。
簡単に言うとこんな感じです。
10xのウェブサイト（日本語）はこちら。
このVisiumの実験には、Chromiumは必要ありません！
ここ、意外と誤解している人が多いのでもう一度言います。Chromiumは必要ありません！
もうひとつ、昨年12月の実験医学別冊「クロマチン解析実践プロトコール」でも、最先端オミクス解析、の章でこのVisiumについて紹介しました！
あと、ちょっと恥ずかしいけれど、VisiumについてYouTubeでも説明しています。もう少し声を張れ、と自分に言いたい。。。
最後にウェビナーのお知らせ。
Visiumを使った研究者の生の発表です！ 2月25日（木）午後2時からです。
国立がん研究センター研究所の森裕太郎先生を演者に迎えて、がんサンプルを用いたVisium空間解析の実例紹介
気付いたら20年の9月から更新していませんでした。ちょうどその頃からTwitterにハマって（ハマるの遅すぎだろ！というツッコミはさておき）、やたらと生物系、医学系をフォローしてはツイートしていました。今更ながら、Twitterって便利で楽ですねー。
僕のフォロワーはほとんど、科学系の研究者、医者、学生、製薬系、同じ業界のヒト、だと思う。多分、変な人はいないと思う。
さて、昨年の9月から更新していなかったわけですが、その間に起こった出来事を並べます。普通のこと書いても面白く無いので私なりにまとめます。
10月：がん学会、がん免疫学会 現地とオンラインのハイブリッド開催：
ランチョンセミナーは私が現地で司会をし、発表者の先生はリモートから参加、という未だかつて無いやり方。コロナ下ではこういう方法もありなんでしょうね。でも現地にいた感想を言うと、オンラインで登場する先生と現場とは微妙に空気が違うかも。
質疑応答の時に、オンライン発表の先生の顔が大画面スクリーンに写し出されるのですが、これはけっこう威圧感あるんですよ。先生、カメラからもう少し離れて、と。あと、現場の音響設備。マイクからの音は良くてもZoomから出て来る音が意外と聴きづらかったりしました。
オンライン同士のディスカッションは、座長がよっぽど気を使わないと仕切が難しいことも判明。突然の通信切れ時はどう間を繋ぐか、などなど。
11月：バーチャルユーザーミーティング開催：
ユーザーミーティング は毎年大きな会場を借りて、参加者を集めて、発表を聴いた後はみんなで懇親会、というのがこれまでの流れでした。本当は今年はホテルの会場を借りて、200人規模でやりたかった。でももちろんそれは無理。そこでバーチャルで行うことに。
このプランは８月頃から立てていて、APACのユーザーミーティングとJapanのをまとめてやろう！ということになり、みんなで準備を頑張った。初のオンライン開催だったのでうまくいくか、トラブルがあった場合どうするか、など心配事は多かったけれど、やってみたら案外大成功だった。
ユーザーミーティングに限らず、ウェビナーなどで先生に発表をお願いするにあたって僕が一番大切だと思っていることは、演者の先生に無理してもらわないこと。先生の研究の進み具合もあるし、発表できるタイミングというのもある。
だから断られることもある。でもたいていは、もう少し論文化の目処がたったら是非協力させてください、という前向きなことが多い。門前払いされることは無いからその点は精神的ショックは無いかな。断られたら素直に引いて、またお声かけしますねー、と言うのがベスト。
日頃からいい関係を築いておくことは大事ですよね。
12月：いろいろあって疲れる：
2020年の締めは外資は12月。一般的に、営業は今年の売り上げに忙殺。マーケは来年のプラン作りに忙殺。これはどの会社でも同じだろうな。気付いたらクリスマス、そして大晦日。
中国の人たちは大晦日まで働くからすごいなと思っていたら、俺たちはChinese New Year（旧暦の正月）で休むから、とのこと。つまり今日（2月11日）から1週間くらい。
1月：新製品発表：
今年は忙しくなりそうな予感しか無い。シングルセルとVisiumで多くの新製品が出ます。メインはこちら
CellPlex：シングルセルのマルチプレックスキット。細胞や核にタグを付けることでサンプルに印をつける。例：４サンプルそれぞれにタグを付けて同時に混ぜ、同じ流路に流すことができる。複数細胞がGEMに入ってしまってもタグを見ることでCellRangerが自動で除去してくれる
LT：低量のシングルセルキット。流路あたり数百〜1000細胞で流すことができる
Fixed RNAキット：PFA固定のRNAに対応したシングルセル用のキット。固定したサンプルからもシングルセル実験ができるようになる
Chromium X：今のChromium Controllerのハイスループット版機種。100万細胞をルーティン処理することを目指す
Visium FFPE：Visium Spatial 解析をFFPEサンプルの切片からでもできるようになるキット。今は新鮮組織切片からのみ
このうち、CellPlexはリリースしました。Visium FFPEは今年の前半にリリース予定。ちゃんとここでも紹介しますね
